محققان MIT فناوری جدیدی را معرفی کردهاند که امکان برچسبگذاری پروتئینها در میلیونها سلول فردی در بافتهای کاملاً دستنخورده را فراهم میکند. این روش که CuRVE نام دارد، این فرآیند برچسبگذاری را بهصورت سریع و یکنواخت انجام میدهد و این امکان را میدهد که نمونههای بزرگ بافتی، مانند مغز کامل جوندگان، در یک روز برچسبگذاری شوند.
این تحقیق در مطالعهای منتشر شده در Nature Biotechnology با عنوان “پردازش یکنواخت تکسلولی برای فنیوتیپینگ مولکولی در مقیاس ارگان” توضیح داده شده است. این کار گامی تحولآفرین در شناسایی بیان پروتئین در سراسر بافتهای متراکم و کامل است.
کوانگهان چونگ، نویسنده ارشد و استاد دانشکده یادگیری و حافظه در موسسه پیکوئر MIT، توضیح داد: «بهطور سنتی، بررسی مولکولها در سلولها نیاز به جداسازی بافتها به سلولهای تکسلولی یا برش آنها به قطعات نازک دارد، زیرا نور و مواد شیمیایی مورد نیاز برای تجزیه و تحلیل نمیتوانند به عمق بافتها نفوذ کنند.»
آزمایشگاه چونگ پیشگام در تولید نوآوریهایی برای تصویرسازی پروتئینها است. وی گفت: «آزمایشگاه ما فناوریهایی مانند CLARITY و SHIELD را توسعه داده است که امکان بررسی ارگانهای کامل را با شفافسازی آنها فراهم میکند.»
سال گذشته تیم این تکنیک تصویربرداری جدیدی را معرفی کرد که امکان تصویربرداری با وضوح بالا و توان پردازش بالا از بافت مغز انسان را بدون آسیب زدن به بافت فراهم میکرد، با استفاده از روش برش و رنگآمیزی mELAST و سیستم محاسباتی UNSLICE که تصاویر سهبعدی حاصل را بهصورت یکپارچه به هم متصل میکرد.
وی ادامه داد: «حال به روشی برای برچسبگذاری شیمیایی ارگانهای کامل نیاز داشتیم تا بتوانیم بینشهای علمی مفیدی کسب کنیم.»
او روش جدید را با استفاده از یک تشبیه توضیح داد: «تصور کنید یک استیک ضخیم را با سس مریناد میکنید. لایههای بیرونی بهسرعت و با شدت سس را جذب میکنند، در حالی که لایههای درونی تقریباً دستنخورده باقی میمانند مگر اینکه گوشت برای مدت طولانی در سس غوطهور شود. همین اصل در پردازش شیمیایی بافتها اعمال میشود: اگر سلولها در یک بافت بهطور یکنواخت پردازش نشوند، نمیتوان آنها را بهطور کمی مقایسه کرد.»
یکی از چالشهای عمده در برچسبگذاری نمونههای بافتی بزرگ، زمان لازم برای نفوذ آنتیبادیها (که به نوعی مشابه سس مریناد عمل میکنند) بهطور کامل در نمونه است. «ممکن است این مولکولها هفتهها طول بکشد تا وارد ارگانهای دستنخورده شوند، که باعث میشود پردازش شیمیایی یکنواخت بافتهای در مقیاس ارگان عملاً غیرممکن و بسیار کند باشد.» به همین دلیل، تیم، چارچوب CuRVE را برای حل این مشکل توسعه داد.
CuRVE بهطور مداوم تعادل دینامیک محیط شیمیایی بافت را حفظ میکند و امکان پراکندگی یکنواخت آنتیبادیها و برچسبگذاری در سراسر بافت را فراهم میآورد. پیادهسازی CuRVE در این مطالعه شامل نوآوریهایی است که سرعت اتصال آنتیبادیها را کنترل کرده و نفوذ آنها را در بافتها افزایش میدهد. آنها شبیهسازیهای محاسباتی توسعه دادند تا پارامترهای مختلف از جمله تغییرات در سرعتهای اتصال و چگالیهای بافتی را بهطور مجازی آزمایش کنند.
این تیم از موفقیتهای قبلی برای پیادهسازی رویکرد خود در نمونههای واقعی استفاده کرد. آنها ابتدا از یک روش پیشین به نام SWITCH استفاده کردند که در آن آنتیبادیها موقتاً خاموش میشوند تا بتوانند به بافتها نفوذ کنند، قبل از اینکه اتصال دوباره فعال شود. اما SWITCH محدودیتهایی داشت که درمانهای مداوم را به دلیل مواد شیمیایی خشن مورد استفاده در این روش ممکن نمیکرد.
با غربالگری یک کتابخانه از مواد شیمیایی، محققان اسید دئوکسیکولیک را بهعنوان گزینهای ایدهآل برای مدولهسازی سرعت اتصال آنتیبادی شناسایی کردند. همچنین، فرآیند برچسبگذاری را با تغییر pH یا غلظت اسید بهینهسازی کرده و از تکنیک دیگری به نام الکترونقل تصادفی (stochastic electrotransport) که توسط آزمایشگاه چونگ توسعه یافته، برای تسریع پراکندگی آنتیبادیها با استفاده از میدانهای الکتریکی بهره بردند.
با ترکیب تکنیکهای تأخیر در فعالسازی آنتیبادیها و تغییر سرعت پراکندگی آنتیبادیها در نمونه با استفاده از چارچوب CuRVE، تکنیک جدیدی به نام eFLASH به وجود آمد.
این تیم موفق شد نمونههای بزرگ بافتی از جمله مغزهای کامل موش و رت، جنینهای کامل موش، و بلوکهای بافتی انسان را با استفاده از eFLASH برچسبگذاری کند. آنها در آزمایشهای خود از بیش از ۶۰ آنتیبادی مختلف استفاده کردند و هر نمونه نیز در یک روز برچسبگذاری شد—در حالی که روشهای رایج معمولاً روزها یا هفتهها طول میکشند. علاوه بر این، این فرآیند نیاز به بهینهسازی مجدد در بین آمادهسازیهای مختلف نداشت که نشاندهنده قدرت و تطبیقپذیری آن است.
دائه هی یون، نویسنده مشترک این تحقیق، مهندس کاربردی در LifeCanvas Technologies و دانشجوی پیشین MIT، اظهار داشت: «این یک گام مهم است، بهویژه از نظر عملکرد واقعی فناوری.»
در آزمایشهای مقایسهای، دقت برچسبگذاری eFLASH بهتر از سلولهای مهندسی ژنتیکی بود که برای تولید فلورسانس برای پروتئین هدف طراحی شده بودند. در برچسبگذاری ژنتیکی، پروتئینهای فلورسانس همیشه بهطور هماهنگ با پروتئین هدف تولید نمیشوند و ممکن است با تأخیر تولید شوند و مدت طولانیتری در سلول باقی بمانند، که دقت برچسبگذاری ژنتیکی را کاهش میدهد.
تیم از eFLASH برای برچسبگذاری سلولهای مهندسی ژنتیکی بهعنوان مقایسه بصری از بیان پروتئین هدف استفاده کرد. با استفاده از سلولهای بیانکننده پاروالبامین (PV)، آنها «کاهش منطقهای و بسیار متغیر سلولهای واکنشدهنده به PV را در موشهای بزرگسال وحشی کشف کردند، یک فنوتیپ که با برچسبگذاری ژنتیکی رایج از دست رفته بود.» بهطور خلاصه، هر روش هم همپوشانی و هم تفاوتهایی در بیان پروتئین هدف در سلولهای برچسبگذاری شده با استفاده از مهندسی ژنتیک و eFLASH نشان میدهد.
یون اشاره کرد که این دو روش «دو ابزار مختلف برای انجام کار هستند.»
نویسندگان بر ویژگی مکمل بودن رویکردهای برچسبگذاری ژنتیکی و آنتیبادی تأکید کردند و پیشنهاد کردند که ادغام هر دو روش ممکن است درک دقیقتری از بیان پروتئینها فراهم کند. همانطور که نویسندگان نوشتند: «کشف ما از کاهش بزرگ منطقهای سلولهای واکنشدهنده به PV در موشهای بزرگسال سالم و با متغیر بودن زیاد فردی، بر اهمیت فنیوتیپینگ جامع و بدون تعصب تأکید میکند.»
چارچوب CuRVE و پیادهسازی آن در eFLASH پیشرفتی قابل توجه در تحلیل تکسلولی حجمی است. با امکان برچسبگذاری پروتئین بهطور جامع در نمونههای بزرگ، این فناوری پتانسیل ایجاد بینشهای بیشتر در زمینههای علوم اعصاب و دیگر حوزهها را دارد. genengnews
